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非典型分支杆菌的分类鉴定方法研究进展

  非典型分支杆菌与结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)复合群、麻风分支杆菌(M. leprae)同属于分支杆菌属(Mycobacterium)。随着对结核杆菌的深入研究,非典型分支杆菌也逐渐引起了人们的关注。为了对非典型分支杆菌进行系统的了解和分类鉴定,就国内外常用的分类鉴定方法进行了综述。 
  关键词非典型分支杆菌;结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis);分类;鉴定 
  中图分类号R378.91;C34 文献标识码A 文章编号439-8114(213)13-2977-3 
  非典型分支杆菌是指除了结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)复合群和麻风分支杆菌(M. leprae)之外的其他分支杆菌,包括偶发分支杆菌(M. fortuitum)、鸟分支杆菌(M. avium)、堪萨斯分支杆菌(M. kanasii)等3多种分支杆菌。非典型分支杆菌生长缓慢,具有一定的致病性,临床表征与结核分支杆菌相似,容易造成误诊。因此,对非典型分支杆菌的分类鉴定就显得尤为重。本研究拟对临床中常用的分类鉴定方法进行综述,旨在为更深入的研究供参考。 
  1 传统分类方法 
  培养分支杆菌常用的培养基有固体培养基,如改良罗氏培养基、匡氏琼脂PNB培养基和Middle brook 7H1、7H11琼脂培养基,在固体培养基中通过观察菌落形态和生长情况鉴定分支杆菌;液体培养基包括Sauton培养基和Middle brook 7H9等,细菌充分接触营养物质时易大量获得细菌,但缺点是易污染,需先进行涂片处理才能观察菌落形态。28年Wang等1检查一位患者咽喉部病变时,经过组织切片和涂片后观察到侵染细菌与鸟分支杆菌复合群相一致。21年Sajduda等2应用PRA(PCR restriction analysis)和传统分离方法鉴定64株分支杆菌,结果表明PRA优于传统方法和特殊DNA测序方法。Guarin等3在研究区分龟亚科分支杆菌-脓肿分支杆菌复合群时,对传统分类方法、高效液相色谱分析方法和实时PCR方法进行了比较试验。由于传统鉴定方法耗时长、对操作求十分严格、培养物易受外界环境污染,所以在实际工作中不易被采用。高效液相色谱法虽然可被广泛应用于非结核性分支杆菌的分类鉴定,但是该方法不能将龟亚科分支杆菌-脓肿分支杆菌复合群里的成员区分开。相对前两种方法,采用实时PCR方法更为快捷省时、操作简单,大大高了工作效率。 
  2 全自动分支杆菌快速生长培养仪检测方法 
  2世纪7年代末,BD公司研制的BACTEC 46-TB成为全球第一台专业的全自动分支杆菌培养鉴定仪,该系统培养基以Middle brook 7H12为基础,在培养基中加入标记14C的棕榈酸,因此也称为放射性同位素液体培养法。张敦熔4在Middle brook系列培养基中加入NAP及其他选择性抑制剂,将培养出来的细菌经过分析仪检测能够快速鉴定出结核与非结核分支杆菌,该技术解决了传统培养方法耗时费力的缺点,使细菌快速培养成为现实。Kontos等5应用全自动分支杆菌快速生长培养仪BACTEC MGIT96和PCR-RFLP相结合的方法检测从临床样本中分离到的分支杆菌,检测结果与常规生化试验检测结果相一致,但在检测的敏感性和时间上明显优于常规检测方法。 
  3 噬菌体分析方法 
  胡忠义等6应用分支杆菌噬菌体D29采用噬菌体生物扩增法鉴定结核和非结核分支杆菌,经过37 ℃感染1 h,结果结核分支杆菌生物扩增检测为阳性,非结核分支杆菌检测为阴性。吕斌等7应用基因工程技术构建可表达荧光素酶的结核分支杆菌重组噬菌体。由于噬菌体具有特异性强、灵敏度高的特点,且不同的分支杆菌发光水平不同,因此重组噬菌体分析方法是一种鉴别结核和非结核分支杆菌的有效方法。 
  4 聚合酶链式反应技术 
  聚合酶链式反应(PCR)技术已广泛应用于分子生物学领域。由于PCR技术具有快速、灵敏度高、操作简单等优点,在分支杆菌鉴定方面也是一种常用的鉴定方法。李国利等8利用双重PCR技术寻找结核与非结核分支杆菌之间的特异性条带,旨在快速鉴定结核与非结核分支杆菌。侯瑞生等9利用多重PCR体系将临床病例标本和标准菌株进行检测比较,结果显示对病例标本和标准菌株的检测灵敏度达到94.6%,特异性达到1.%。吴雪琼等1利用不同细菌的单链DNA构象不同的特点,建立了PCR-SSCP单链构象多态性聚合酶链式反应体系,用以区别结核与非结核分支杆菌。Yamada-Noda等11根据dnaJ基因建立PCR反应体系。结果表明,在54株模式株中,dnaJ的同源性为8.4%,低于16S rRNA的96.6%、rpoB的91.3%和hsp65的91.1%,dnaJ PCR技术可以作为一种新的方法区别结核与非结核分支杆菌,利用通用引物建立PCR反应体系并进行测序分析可以准确地鉴定出多种分支杆菌。Selvaraju等12利用hsp65基因限制性分析龟亚科分支杆菌复合群,该方法根据hsp65基因的多态性可以将复合群里的每种菌株分别鉴定出来。Martin等13利用生化方法、hsp65基因PCR-RFLP和PRA技术鉴定从人类临床标本中分离出分支杆菌,结果表明,相对一般生化方法,PRA技术操作简单、方便、快捷,是一种可靠的鉴定方法。Sajduda等14应用PRA配合毛细管电泳法,分离鉴定出27株堪萨斯分支杆菌和29株龟分支杆菌-脓肿分支杆菌复合群。结果表明,PRA技术配合毛细管电泳法能够快速准确地鉴定分支杆菌。 
  5 核酸探针技术 
  核酸探针技术是将一段带有标记的核酸片段在一定的温度、pH等条件下与核酸互补链通过氢键结合形成稳定的复合物结构,经过显影技术显示结果。李国利等15以16 S-23 S rDNA内转录间隔区序列为靶基因设计核酸探针,利用PCR-反向杂交技术可以将分支杆菌鉴定到种的水平。还可以利用生物素标记临床样本的核酸制成探针,与标准菌株DNA杂交,以大肠杆菌作为阴性对照,可以快速将细菌鉴定到种。梁建琴等16运用16 S rRNA-寡核苷酸探针反向杂交阵列法检测临床样本中的分支杆菌,结果显示寡核苷酸探针特异性强、检测灵敏度高,可作为鉴定临床分支杆菌菌种的方法。Tobler等17采用hsp65实时PCR和DNA微阵列法快速检测37株分支杆菌,结果鉴定出34株分支杆菌,与16 S rRNA的测序结果一致。Sun-Joon等18采用rpoB PCR-反向DNA寡核苷酸特异性探针鉴定分支杆菌,从54株临床样本中分离出48株鸟分支杆菌和6株胞内分支杆菌,其他菌株经鉴定分别为366株结核分支杆菌、9株脓肿分支杆菌、8株偶发分支杆菌、2株浅黄分支杆菌和11株外来分支杆菌。该方法快速、准确、敏感度高、特异性强。
  6 细胞脂肪酸成分分析方法 
  将细菌制成冻干粉后,将粉末经过甲酯化,供气相色谱仪或色谱/质谱仪(GC/MS)分析,由于非结核分支杆菌含有结核分支杆菌所没有的特征脂肪酸,经过仪器分析鉴定出异十六烷酸、异十七烷酸、十六烯酸、十八烯酸、十八二烯酸等成分,进一步探明了其组分的化学本质,鉴定出戈登分支杆菌(M. gordonae)无结核分支杆菌硬脂酸,牛型结核分支杆菌(M. bovis)没有α-甲基十八烯酸,为分支杆菌脂肪酸分析供了科学依据。美国MIDI公司生产的全细胞脂肪酸分析系统,通过使用安捷伦的气相色谱、MIDI微生物数据库和MIDI图谱识别软件来鉴定每个菌株,对菌株的鉴定表现得更为客观,减少了人为因素造成的错误,并能鉴定到种的水平。 
  7 气相色谱法和薄层层析法 
  将气相色谱法与传统生物学鉴定方法进行对比,结果两种方法鉴定出的分支杆菌94.%相符合。用气相色谱法和薄层层析法相结合将28种标准菌株中85.%的菌株区分开来。另外,Rebuffo-Scheer等19利用傅里叶变换红外显微分光镜检查法鉴别分支杆菌。利用红外线光谱得到的线性反应建立标准化模式,可以根据光谱分析快速检测临床标本的未知分支杆菌。 
  8 结语 
  临床中用于鉴定非典型分支杆菌的方法很多,以上介绍的是国内外较为常用的几种分类鉴定方法。每种方法都有其优缺点,因此,往往根据实际需采用几种方法联合应用,如利用传统培养方法进行培养,再配合PCR技术、核酸探针技术进行鉴定,或者利用PCR技术与反向核酸探针技术相结合的方法,能够更加系统、全面地对非典型分支杆菌进行分类鉴定,对临床研究非典型分支杆菌有很大的帮助。 
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